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WB条带大小和蛋白预测八字不合?

实验室玄学千千万,预测和结果不符占一半。

WB实验是各位小伙伴们,时常光顾的一个实验。但就是这样一个初级又常用的实验,却会出现各种稀奇古怪的问题。

怎么我的条带每次都不一样!

 

比如在WB实验鉴定蛋白时,我们得到的蛋白质条带大小常常会和预测值有所偏差。这是身患“强迫症”的小伙伴们不能忍的。

猛男落泪,谁来看看到底问题在哪里?

 

如果是实验出错或者预测不准这种情况,小编是没办法跳出手机屏幕救你了。

但这下面的5条准则,小伙伴们倒是可以珍藏一下,在遇到蛋白质条带大小和预测值偏差的时候,拿出来分析一下。

我们可以对照着这张图来看原因。

下面小编就来详细地讲解一下这5条具体是个啥。

当我们做WB实验鉴定蛋白的时候,最喜欢看到的是这样的条带:

但通常,自己做出来的,就会变成这样:

 

是生活对我们这些实验小可爱下手了吗?

还是水逆没过去?

为什么 WB 跑了这么多次,

都和预测差了这么多? 

当然不是那些玄学原因啦。让我们科学地分析一下到底是哪里出了问题。

 内源性蛋白 or 重组蛋白

查问题要从源头查起,所以各位小伙伴们要先看一看样品是内源性蛋白还是重组蛋白?

如果是内源性蛋白还不打紧,如果是重组蛋白,那么马上就要看一看重组蛋白是否为全长序列了。假如样品是重组蛋白,还不是全长序列,那么条带大小一定会和预测大小不一致。

多个 isoform 辨仔细

如果确定了样品是内源蛋白,那就要看看我们的目标蛋白是不是有其他的 isoform,这个我们通常会去查看NCBI或者SWISSPROT来确认。

 SWISSPROT 会标出有些基因有多种 isoform

做着实验,结果换了别的 isoform 可就一顿瞎忙活啦。

剪切活化要注意

如果在 SWISSPROT 或者权威的文献里提到了,样品的这个蛋白需要剪切活化,那么结果又要和预测值不同啦。

成倍增长多聚体

如果蛋白大小和预测值有明显倍数关系,那就要考虑一下这个蛋白是不是二聚体或者多聚体啦。

蛋白修饰要变大

如果排除了以上4条原因,预测值和实验结果不一致,那就是因为我们面对的蛋白质,是个善变的对象,它不仅会剪切活化,还有在翻译表达后修饰。

比如:比如甲基化、乙酰化、磷酸化、糖基化、烷基化、生物素化、谷氨酸化、甘氨酸化、硫酸化、异戊二烯化、硫辛酸化、磷酸泛酰巯基乙胺基化……balabala。

在不同状态下的蛋白质还会有不同的修饰。加入了官能团肯定会让蛋白质比预测值偏大在日常的实验中,糖基化是比较常见的修饰,一般会导致跑出来的条带比预测值大那么一些。

SWISSPROT 会给出蛋白质修饰位点信息,各个都有支持依据哦~

让小编最后再总结一下。

当WB大小和预测值不一致时

● 确定蛋白是内源的还是外源的,如果是外源蛋白是不是全长序列;

● SWISSPROT数据库查询该蛋白是否有其他isoform;

● SWISSPROT和文献查询蛋白质是否有剪切活化,剪切活化造成蛋白变小;

● 确定蛋白质是否是二聚体或多聚体。

● NCBI和SWISSPROT查询蛋白质表达后是否有修饰,如有修饰会导致蛋白质增大;

 

以上就是小编给出的 5 条小贴士,拿去分析下自己的条带问题绝对是绰绰有余了。如果用过了这 5 条,还是没找到问题在哪里,那就要回过头看看是不是预测不准或者实验出错啦。

本文转自Abcam微信公众号。

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